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      技術文章

      cellendes 3D細胞水凝膠系統(tǒng)使用操作步驟

      技術文章

      德國cellendes的3D細胞水凝膠系統(tǒng)是一套用于3D細胞培養(yǎng)時構建細胞外基質(zhì)組分的試劑。使用者可以利用這些試劑控制細胞外環(huán)境,設計適合細胞生存的3D系統(tǒng)。

      3D細胞水凝膠系統(tǒng)與活體細胞外基質(zhì)相似,采用該系統(tǒng)可使體外細胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征,是基礎研究、藥物篩選和再生醫(yī)學等領域細胞功能研究的理想選擇。



      一、使用cellendes 3D細胞水凝膠系統(tǒng)時的注意事項:


      1. 所有步驟均在無菌環(huán)境下操作。
      2. 一般選擇使用10x CBpH 5.5,10x CBpH 5.5不適合時,才會使用10x CBpH 7.2 。但是使用10x CBpH 7.2時,凝膠形成的速度很快,降低CB的pH值,可以減緩凝膠形成的速度,可以混合10x CBpH 5.5和10x CBpH 7.2 。



      CBpH 5.5和CBpH 7.2混合后CB的pH值(詳見說明書p10)


      3. 細胞懸液: PBS或培養(yǎng)基懸液
      4.  Mal-PVA或Mal-Dextran溶解后冰浴上使用。溶解后應放于-80℃保存,使用時避免反復凍融,如果短期內(nèi)使用,可以4℃放置(1周左右)
      5. PEG-link和CD-link不要長時間暴露在空氣中



      二、使用cellendes 3D細胞水凝膠系統(tǒng)時實驗前準備:


      1. 解凍、溶解3D水凝膠組分(詳見說明書),保證全部溶解
      2. 如果3D水凝膠需添加RGD肽(詳見說明書):
      A. 用水溶解RGD肽,使終濃度是3.0mmol/L
      B. 如需比較RGD肽不同濃度的效果,會使用硫代甘油,需將硫代甘油:水=1:6.7溶解,使終濃度是3.0mmol/L
      3. 保證Mal-PVA或Mal-Dextran 冰浴上
      4. 準備細胞懸液(PBS或培養(yǎng)液),建議細胞懸液濃度時2-4 x106/ml,使zui終濃度時10000-20000個細胞/30ul



      三、無RGD肽時cellendes 3D細胞水凝膠系統(tǒng)實驗操作:


      注:需保證馬來酰亞胺基團(Mal- )和硫醇基團(SH- )等量
      可以預實驗決定凝膠強度

      注:CBpH5.5和細胞懸液的量是不變的,為了保證等滲條件


      實驗步驟如下:


      A.按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細胞懸液于一管(管1)中
      B.將PEG-link(或CD-link)滴加到培養(yǎng)皿表面
      C. 用吸頭吸出管1中的組分,與培養(yǎng)皿上的PEG-link(或CD-link)混合,快速吹打3-4次
      D. 避免產(chǎn)生氣泡,放置至少一分鐘(3-5min),等待凝膠形成
      E. 一旦凝膠形成,輕輕加培養(yǎng)液至覆蓋住凝膠,蓋上培養(yǎng)皿蓋,至合適的溫度孵育
      F. 兩個小時后更換新培養(yǎng)基



      四、用RGD肽時cellendes 3D細胞水凝膠系統(tǒng)實驗操作:


      一般情況下1mmol/l或低于1mmol/l的RGD肽,就可以提供足夠的粘附力
      當需比較RGD肽濃度以及是否需要使用RGD肽時,需用到硫代甘油
      下表中列舉的是:馬來酰亞胺基團(Mal--)=硫醇基團(SH--)=5mmol/l,選擇zui合適RGD肽濃度時,需用硫代甘油來調(diào)節(jié)


       如確定交聯(lián)強度是5mmol/l,可按下表預實驗RGD肽濃度



      實驗步驟如下:


                           實驗操作示意圖(30ul體系)


      A. 按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細胞懸液于一管(管1)中
      B. 添加RGD肽和硫代甘油于管1中,快速混勻,室溫放置5-10min,有足夠的時間使RGD peptide共價結合到馬來酰亞胺基團(Mal- )上
      C. 將PEG-link(或CD-link)滴加到培養(yǎng)皿表面
      D. 將細胞懸液添加到管1中
      E. 用吸頭吸出管1中的組分,與培養(yǎng)皿上的PEG-link(或CD-link)混合,快速吹打3-4次
      F. 避免產(chǎn)生氣泡,放置至少一分鐘(3-5min),等待凝膠形成
      G. 一旦凝膠形成,輕輕加培養(yǎng)液至覆蓋住凝膠,蓋上培養(yǎng)皿蓋,至合適的溫度孵育
      H. 兩個小時后更換新培養(yǎng)基



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      1.3D細胞水凝膠(3D life hydrogel)

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      3.聚苯乙烯3D細胞培養(yǎng)支架(3D Insert-PS)--3D Biotek

      4.聚已內(nèi)酯3D細胞培養(yǎng)支架(3D Insert-PCL)-3D biotek


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